Định lượng các yếu tố dựa trên cơ sở thời gian Throboplastin từng phần
ĐỊNH LƯỢNG CÁC YẾU TỐ DỰA TRÊN CƠ SỞ
THỜI GIAN THROMBOPLASTIN TỪNG PHẨN
(Yếu tố VIII, IX, XI và XII)
- Nguyên lý
Thời gian thromboplastin từng phần của huyết tương người hay huyết tương bò không có một trong các yếu tố VIII, IX, XI và XII sẽ bị kéo dài. Thời gian này sẽ được điều chỉnh khi bổ sung huyết tương có yếu tố thiếu hụt đó. Mức độ điều chỉnh phụ thuộc nồng độ yếu tố thiếu hụt trong huyết tương bổ sung. Dựa vào đó, người ta pha loãng huyết tương cần xét nghiệm ra các nồng độ khác nhau và trộn với huyết tương không có yếu tố cần khảo sát (huyết tương thử) để theo dõi mức độ điều chỉnh và tính ra nồng độ yếu tố đông máu đó.
Ở đây chúng tôi mô tả phương pháp định lượng yếu tố VIII c một thì còn phương pháp định lượng các yếu tố IX, XI, XII cũng tương tự.
- Kỹ thuật
2.1. Định lượng yếu tố VIII c
2.1.1. Dụng cụ, hoá chất
– Huyết tương thử: là huyết tương không có yếu tố VIII c, có thể dùng loại đông khô bán sẵn, có thể dùng huyết tương của bệnh nhân hemophilia A có hoạt tính yếu tố VIII c dưới 1% hoặc có thời gian sinh thromboplastin từng phần hoạt hoá trên 150 giây và không có kháng thể kháng yếu tố VIII c.
– Cephalin: có thể dùng loại đông khô bán sẵn hoặc tự sản xuất tại phòng thí nghiệm.
– CaCl2 M/40.
– Kaolin: 5 g/1 trong đệm.
– Huyết tương chứng: có thể dùng pool huyết tương của người bình thường, có thể dùng huyết tương đã biết trước hoạt tính yếu tố VIII c.
2.1.2. Quy trình kỹ thuật
– Lấy máu bệnh nhân tách huyết tương như xét nghiệm thời gian Howell.
– Pha loãng huyết tương
+ Pha loãng huyết tương chứng theo tỷ lệ: 1/10, 1/20, 1/40, 1/80 trong đệm Michaelis pH 7,3.
+ Pha loãng huyết tương bệnh nhân theo tỷ lệ 1/10 (nếu bệnh phẩm là mẫu yếu tố VIII cô đặc thì cần pha loãng hơn).
– Tiến hành xét nghiệm:
+ Xây dựng đồ thị chuẩn: trong một dãy ống nghiệm:
Mỗi ống cho 0,1 ml huyết tương chứng ở mỗi nồng độ pha loãng,
0,1 ml huyết tương thỏ (không có yếu tố VIII C),
0,1 ml hỗn dịch cephalin-kaolin ủ ở bình cách thuỷ 37°c trong 2 phút.
Sau đó thêm 0,1 ml CaCl2 M/40 .
Bấm đồng hồ, theo dõi thời gian đông.
Dựa vào thời gian đông ở các độ pha loãng, ta dựng một đồ thị trong đó trục tung là thời gian đông của các độ pha loãng, trục hoành là hoạt tính của yếu tố VIII c. Đồ thị sẽ là một đường thẳng.
+ Xét nghiệm mẫu kiểm tra: các bước tiến hành như đối với huyết tương chứng.
Dựa vào đồ thị ta tính được nồng độ yếu tố VIII c.
– Hoạt tính yếu tố VIII c của người bình thường là 50 – 200%.
2.1.3. Nguyên nhân sai lầm
– Huyết tương thử chưa đúng tiêu chuẩn (còn hoạt tính VIII c trên 1 %).
– Kết quả thời gian đông của các nồng độ pha loãng huyết tương chứng không chính xác nên đồ thị không phải là một đường thẳng.
– Một số nguyên nhân chung: dụng cụ làm xét nghiệm không sạch, lấy bệnh phẩm không chuẩn.
Lưu ý: Ngoài sử dụng huyết tương chứng, người ta còn dùng huyết tương chuẩn để kiểm tra, quy trình giống như đối với huyết tương chứng và đồ thị là một đường thẳng song song với đưòng thẳng của huyết tương chứng.
2.2. Định lượng các yếu tố khác
Các bước tiến hành tương tự định lượng yếu tố VIII c, ở đây chỉ trình bày cách chuẩn bị huyết tương thử.
2.2.1. Định lượng yếu tố IX
Huyết thanh không có yếu tố IX:
– Lấy 3 ml máu bệnh nhân bị bệnh hemophilia B cho vào ống nghiệm nhỏ
– Cho thêm vào 3 giọt thromboplastin đã pha loãng 1/10 trong dung dịch NaCl 0,9% hoặc dung dịch đệm Michelis pH 7,3.
– Để đông ở thùng cách thuỷ 37°c trong 4 giờ cho cục máu co hoàn toàn, quay ly tâm tách huyết thanh.
2.2.2. Định lượng yếu tố XI
Huyết tương không có yếu tố XI:
– Lấy máu chống đông bằng citrat
– Ly tâm mạnh tách lấy huyết tương nghèo tiểu cầu
– Hoạt hoá yếu tố XII bằng Celit
– Để ở bình cách thuỷ 37°c trong 6 giờ để tiêu thụ hết yếu tố XI.
– Thử lại thời gian APTT, chỉ sử dụng làm huyết tương thử khi thời gian APTT từ 150 giây trở lên.
Lưu ý:
Máu của bệnh nhân hemophilia dùng sản xuất thuốc thử phải không có kháng thể kháng yếu tố đó ( IX, XI).
