Quy trình xét nghiệm tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn WHO 2010
I. CHUẨN BỊ VÀ LẤY MẪU
1. Chuẩn bị lấy mẫu
– Mẫu thử nên được lấy tại phòng riêng gần phòng xét nghiệm để hạn chế sự thay đổi nhiệt độ đột ngột của tinh dịch và cũng để theo dõi thời gian ly giải của tinh dịch
– Thời gian kiêng xuất tinh tối thiểu là 2 ngày, tối đa là 7 ngày. Trong trường hợp có yêu cầu kiểm tra lại thì số ngày kiêng nên giống nhau.
– Bệnh nhân cần nắm rõ thông tin về cách lấy mẫu như: phải thu thập toàn bộ mẫu và phải thông tin cho nhân viên y tế khi làm rơi vãi.
2. Cách lấy mẫu
– Tinh dịch được lấy bằng tay như thủ dâm và xuất tinh trực tiếp vào lọ đựng mẫu.
– Lọ đựng tinh dịch phải được tiệt trùng và làm bằng loại nhựa không ảnh hưởng đến tinh trùng.
– Sau khi thu thập mẫu, lọ chứa mẫu được giữ ấm ở nhiệt độ 20-37 C và chuyển ngay đến phòng xét nghiệm. Đặt lõ mẫu trong tủ ấm 37 để theo dõi thời gian ly giải.
3. Vô trùng trong lấy mẫu
– Đi tiểu thật sạch trước khi lấy mẫu
– Rửa tay và dương vật bằng xà phòng để tránh nhiễm bẩn tinh dịch cho các loại vi khuẩn trên da
– Rửa nước thật sạch xà phòng để không làm ảnh hưởng tới tinh trùng
– Lau khô tay và dương vật bằng khăn sạch
– Xuất tinh trực tiếp vào lọ đựng mẫu
4.Thời điểm khảo sát và sự an toàn khi thao tác với mẫu thử.
– Mẫu thử sẽ được khảo sát đại thể và vi thể tại phòng xét nghiệm, thực hiện việc khảo sát trong vòng 1 giờ sau khi nhận mẫu, không nên để mẫu thử quá 2 giờ sẽ ảnh hưởng đến sự di động và tỉ lệ sống của tinh trùng.
– Do mẫu tinh trùng là tác nhân gây hại: HIV, Herpes simplex..nên bệnh nhân cần được kiểm tra HIV, HbsAg, BW trước khi lấy tinh dịch để phòng tránh sự lây nhiễm.
II. KHẢO SÁT ĐẠI THỂ
1. Sự ly giải
– Tinh dịch mới xuất tinh được cho vào tủ ấm 37 để theo dõi sự ly giải, sau 15 phút khảo sát sự hóa lỏng bằng cách lắc nhẹ, nếu chưa hóa lỏng hoàn toàn nên tiếp tục để tủ ấm thêm 15 phút nữa. Nếu sau 30 phút tinh dịch không ly giải thì để thêm 30 phút nữa nhưng không quá 60 phút
– Xử lý mẫu không lý giải:
+ dùng bơm kim tiêm 18G hay 19 G hút lên hút xuống (6-10 lần)
+ có thể pha loãng tinh dịch tỉ lệ ½ với 10 IU/ml bromelain, để tủ ấm 10 phút trước khi đánh giá
2. Độ nhớt
– Đánh giá độ nhớt bằng cách quan sát sự kéo dài của giọt tinh dịch được nhỏ bằng pipette Pasteur. Độ nhớt bình thường khi giọt tinh dịch nhỏ rởi rạc từng giọt, nếu bát thường thì giọt tinh dịch dài trên 2cm.
– Xử lý mẫu tinh dịch độ nhớt cao: cũng giống như cách xử lý mẫu không ly giải
3. Tính chất tổng quát
– Tinh dịch bình thường sau ly giải có tính đồng nhất, màu trắng hoặc xám đục
– Tinh dịch có màu bất thường: đỏ nâu do lẫn hồng cầu, loãng trong do thiểu tinh hoặc vô tinh…
4. Thể tích
– Thể tích tốt nhất được đo bằng phương pháp đo trọng lượng mẫu. Tỷ trọng tinh dịch bằng 1g/ml
– Thể tích cũng có thể được đo bằng hút tinh dịch từ lọ vào pipette hay ống nghiệm có chia vạch
5. pH tinh dịch
– pH được đo vào thời điểm nhất định sau 30 phút đến không quá 1 giờ sau khi xuất tinh.
– Nhỏ 10 l lên giấy chỉ thị mầu, so mầu theo bảng mẫu và xác định pH sau 30s
III. KHẢO SÁT VI THỂ
1.Đánh giá tổng quát
– Sử dụng kính hiển vi (KHV) đánh giá khởi đầu bằng vật kính 10x, xem sự phân tán của tinh trùng (TT) trong tiêu bản, ghi nhận sự kết dính, kết đám, bạch cầu, TT non hay tế bào biểu mô nếu có
– Sự kết đám: xảy ra khi những TT chết cùng với các tế bào khác hoặc cặ tụ lại với nhau.
– Sự kết dính: sự dính chặt những TT sống di động với nhau theo kiểu đầu với đầu, đuôi với đuôi hoặc hỗn hợp. Mức độ kết dính chia làm 4 loại:
+ loại 1: < 10 TT/ mỗi kết dính, nhiều TT tự do
+ loại 2: 10 – 50 TT/ mỗi kết dính, có TT tự do
+ loại 3: > 50 TT, vài TT vẫn tự do
+ loại 4: tất cả TT kết dính lại với nhau
2. Đánh giá độ di động của tinh trùng
Được đánh giá ngay sau khi tinh dịch ly giải hoàn toàn, sau 30 phút nhưng không quá 60 phút sau xuất tinh. Theo tiêu chuẩn WHO 2010, tiêu chuẩn đánh giá sự di động của TT được phân làm 3 loại:
– TT di động tiến tới – PR: TT di động tiến tới trước, tốc độ di chuyển không quan trọng
– TT di động không tiến tới – NP: TT di chuyển khó khăn, di động tại chỗ
– TT không di động – IM: TT bất hoạt, không di động
2.1 Cách đánh giá phân loại di động trên lam
– Tạo tiêu bản ngay sau khi trộn mẫu thật đều, để TT ổn định trong 1 phút. Khảo sát dưới KHV vật kính 40x. Đánh giá trên một vùng giới hạn của vi trường nếu mật độ TT quá nhiều, đánh giá trên toàn bộ vi trường nếu mật độ quá ít.
– Đánh giá một cách có hệ thống ít nhất 5 vi trường để xếp loại TT, đánh giá những TT còn nguyên vẹn đầu đuôi, đếm ít nhất 200TT để hạn chế sai số và tránh lựa chọn vùng chỉ có đa số TT di động
2.2. Cách đánh giá phân loại di động trên buồng đếm
– Dùng máy bách phân bạch cầu để phân loại TT. Trong vùng giới hạn, cùng một thời gian các TT di động tiến tới trước (PR) được đếm trước, sau đó là NP và IM. Không nên đợi TT bơi vào vùng đánh giá mới đếm
– Trường hợp tổng số 200 TT đạt được trước khi tất cả các loại di động còn lại chưa được đếm từ cùng vùng đánh giá, nên đếm tiếp tục các loại di động còn lại dù hơn tổng số 200. Tính trung bình cộng và tỉ lệ khác biệt giữa 2 lần đếm của PR, NP, IM. Chọn tỉ lệ trung bình cao nhất trong 3 giá trị để so với tỉ lệ khác biệt cho phép (Bảng 1)
+ nếu khác biệt vượt quá giới hạn cho phép → tạo tiêu bản khác đánh giá lại
+ nếu khác biệt chấp nhận được → kết quả là tỉ lệ trung bình PR, NP, IM
Tỉ lệ trung bình
(%)Tỉ lệ khác biệt cho phép
 |
| Bảng 1: Tỉ lệ khác biệt cho phép giữa tỉ lệ trung bình và khác biệt giữa hai lần đếm |
3.Đánh giá tỉ lệ sống của tinh trùng
Những TT còn sống trong mẫu dược đánh giá qua tính nguyên vẹn của màng bào tương TT. TT còn sống có khả năng kháng thuốc nhuộm hay căng phồng trong dung dịch nhược trương.
– Nhuộm Eosin – Nigrosin
+ lắc đều mẫu
+ trộn đều 50µl tinh dịch với 50µl Eosin – Nigrosin, đợi 30s
+ trộn đều mẫu và tạo tiêu bản để khô
+ khảo sát dưới KHV vật kính 100x, đếm số TT bắt màu và không bắt màu thuốc nhuộm
+ đánh giá 200TT để hạn chế sai số, tính % TT sống và TT chết
+ tính tỉ lệ trung bình và tủ lệ khác biệt giữa 2 lần đếm, so sánh với Bảng 1
→ nếu khác biệt chấp nhận được, kết quả là trị số trung bình
→ nếu khác biệt vượt quá cho phép, tạo tiêu bản khác đánh giá lại
– Đánh giá tỉ lệ sống qua HOS test (được áp dụng cho mẫu TT bất động hoàn toàn nhằm chọn TT cho ICSI). Thuốc thử: hòa tan 0.735g sodium citrate dihydrate + 1,351 g đường D-fructose trong 100ml nước cất, bảo quản ở nhiệt độ -20 .
+ làm ấm 1ml thuốc thử ở 37 / 5 phút
+ lắc đều mẫu tinh dịch, hút 100µl tinh dịch cho vào thuốc thử, trộn dều bằng pipette
+ nuôi cấy ở 37 ./ 5-30 phút. Sau đó hút 10µl đặt lên lam, đậy lam phủ và quan sát trên KHV
+ đếm TT không căng phồng màng và TT căng phồng màng bằng máy bách phân
+ đánh giá 200TT để hạn chế sai số, tính % TT sống và TT chết
+ tính tỉ lệ trung bình và tủ lệ khác biệt giữa 2 lần đếm, so sánh với Bảng 1
→ nếu khác biệt chấp nhận được, kết quả là trị số trung bình
→ nếu khác biệt vượt quá cho phép, tạo tiêu bản khác đánh giá lại
4. Đánh giá mật độ tinh trùng
4.1 Các bước thực hiện
– Trộn đều mẫu tinh dịch sau khi ly giải hoàn toàn, nhỏ 10µl tinh dịch lên lam, đậy lam phủ
– Quan sát dưới KHV vật kính 40x để xác định độ pha loãng phù hợp. Thường chọn độ pha loãng lúc đánh giá di đông
– Trộn tinh dịch và chuẩn bị pha loãng
– Nhỏ mẫu pha loãng vào buồng đếm neubauer, để yên 1 phút cho TT ổn định
– Đánh giá mẫu TT trong vòng 10-15 phút, đếm ít nhất 200TT trên mỗi buồng
– So sánh kết quả giữa 2 lần đếm, nếu gần giống nhau có thể tính mật độ, nếu khác biệt nhiều thì pha loãng làm lại
– Tính mật độ TT trong 1ml và tổng số TT trong mẫu xuất tinh
4.2 Tỷ lệ pha loãng và vị trí khảo sát mật độ trên buồng đếm
– Pha loãng tinh dịch với dung dịch NaHCO3 5% trong 2 ống nghiệm, độ pha loãng như nhau. Cách xác định độ pha loãng và chọn vùng đánh giá theo Bảng 2.
 |
| Bảng 2: Độ pha loãng, cách pha, vùng đếm TT |
– Đánh giá số lượng TT trên buồng đếm
+ khảo sát đánh giá với vật kính 40x
+ đêm sít nhất 200 TT trên mỗi buồng của buồng đếm
+đánh giá lưới ô vuông số 5 trước, bắt đầu từ cạnh của lưới ô vuông, đếm TT theo từng hàng
+ đếm ít nhất 200 TT, tiếp túc đếm đến hết hàng cho dù hơn tổng số 200
+ nếu đếm chưa đủ 200 TT trong 5 hàng của lưới ô vuông 5, đếm tiếp tục những hàng trong lưới ô vuông số 4 và 6
+ ghi nhận số hàng đánh giá đạt ít nhất 200TT, số hàng tương tự sẽ được đếm ở buồng thứ của buồng đếm
+ đếm số TT và số hàng bằng máy bách phân
+ chuyển sang buồng đếm thứ 2 và thực hiện như buồng thứ 1
+ tính tổng và hiệu cảu 2 lần đếm, so sánh khác biệt cho phép theo Bảng 3
→ nếu khác biệt chấp nhận được, kết quả là trị số trung bình
→ nếu khác biệt vượt quá cho phép, tạo tiêu bản khác đánh giá lại
– Công thức tính mật độ:
C= N/n x1/20 x (hệ số pha loãng) (106/ml)
C: mật độ TT
N: tổng số TT trong 2 lần đếm
n: tổng số hàng khảo sát
– Tổng số TT trong mẫu xuất tinh:
Tổng số TT trong mẫu = Mật độ TT/ml x Thể tích mẫu
4.3 Đánh giá số lượng tinh trùng ít
Khi không thấy TT trong tiêu bản soi tươi nên ly tâm toàn bộ mẫu để xác định mẫu tinh dịch có sự hiện diện của TT hay không
– Ly tâm toàn bộ mẫu với tốc độ 3000v/15 phút
– Bỏ phần trên để cặn khoảng 50µl, trộn đều cặn tạo 2 tiêu bản
– Khảo sát trên vật kính 40x trên toàn bộ tiêu bản
→ có TT trong cặn khảo sát: Cryptozoospermia
→ không có TT trong cặn: Azoospermia
 |
| Bảng 3: Khác biệt cho phép giữa tổng và hiệu số 2 lần đếm |
5. Đánh giá mật độ tế bào lạ
– Xác định số lượng tế bào tròn trong mẫu bằng cách pha loãng và đếm trong buồng đếm Neubauer tương tự như tính mật độ TT.
– Nếu mật độ tế bào tròn vượt quá 1 triệu/ ml, cần phân biệt bạch cầu và TT non trên tiêu bản nhuộm papanicolau
– Cách tính mật độ tế bào lạ:
Công thức: C = S x N/400
N: số tế bào lạ đếm được trong cùng số vi trường 400 TT
S: mật độ TT
C: mật độ tế bào lạ
– Tổng số tế bào lạ trong mẫu = Mật độ tế bào lạ x Thể tích mẫu
6. Hình dạng tinh trùng
6.1 Các bước đánh giá hình dạng tinh trùng
– Làm sạch lam bằng alcol 70%, để khô
– Tạo phiến phết tinh dịch
– Để khô, cố định và nhuộm phiến phết bằng phương pháp nhuộm Papanicolau
– Khảo sát tiêu bản nhuộm dưới KHV vật kính 100x
– Đánh giá phân loại TT bình thường và bất thường
– Đánh giá 2 tiêu bản, mỗi tiêu bản 200 TT
– Tính % hình dạng bình thường, tính trung bình và hiệu cảu 2 lần đếm
– So sánh sự khác biệt cho phép theo Bảng 3
→ nếu khác biệt chấp nhận được, kết quả là trị số trung bình
→ nếu khác biệt vượt quá cho phép, tạo tiêu bản khác đánh giá lại
6.2 Chuẩn bị tiêu bản nhuộm
– Nếu mật độ TT > 20 triệu/ ml thì lấy 5-10µl tinh dịch kéo lam
– Nếu mật độ TT< 20 triệu/ ml thì lấy 10-20µl tinh dịch kéo lam
– Kéo dàn đều tiêu bản, để khô tự nhiên
6.3 Phương pháp nhuộm Papanicolau
– Cố định: ngâm phiến phết trong ethanol 95% ít nhất 1 phút trước khi nhuộm
– Nhuộm: ngâm phiến phết liên tục theo các bước sau:
1) Ethanol 800 …………….….30 giây
2) Ethanol 500…………………30 giây
3) Nước cất……………………30 giây
4) Haematoxylin………………4 phút
5) Nước cất……………………30 giây
6) Acidic ethanol………………4-8 giây
7) Rửa nước……………………5 phút
8) Ethanol 500…………………..30 giây
9) Ethanol 800………………….30 giây
10) Ethanol 950………………….15 phút
11) OG6……………………1 phút
12) Ethanol 950…………….30 giây
13) Ethanol 950…………….30 giây
14) Ethanol 950…………….30 giây
15) EA50……………………1 phút
16) Ethanol 950…………….30 giây
17) Ethanol 950…………….30 giây
18) Ethanol 1000……………15 giây
19) Ethanol 950….…………..15 giây
6.4 Phân loại hình dạng tinh trùng
– Những TT bình thường bao gồm đầu, cổ , phần giữa và đuôi đều bình thường.
+ đầu hình bầu dục với đường nét rõ ràng, dài 3,7 – 4,7µm, rộng 2,5 – 3.2µm, tỉ lệ dài và rộng là 1,3 – 1,8.
+ cực đầu chiếm 40 – 70% so với thể tích vùng đầu. Cực đầu không có không bào lớn hoặc không có nhiều hơn 2 không bào nhỏ và không chiếm quá 20% thể tích vùng đầu. Vùng sau cực đầu không chứa bất cứ không bào nào.
+ phần giữa thon, bề ngang 0,5 – 0,7 µm, dài 3,3 – 5,2µm, gắn thẳng với trục đầu
+ bào tương sót lại < 1/3 so vói kích thước đầu bình thường
+ Đuôi thẳng, đều, thon, dài khoảng 45µm
– Theo tiêu chuẩn nghiêm ngặt tất cả các TT không có hình dạng mô tả trên được coi là TT bất thường.
